डीएनए क्लोनिंग | विज्ञान और प्रौद्योगिकी (Science & Technology) for UPSC CSE PDF Download

परिचय

• डीएनए क्लोनिंग प्रक्रिया: डीएनए क्लोनिंग में किसी विशेष आनुवंशिक घटक या डीएनए के टुकड़े की कई समान प्रतियों का निर्माण करना शामिल है। यह प्रक्रिया लक्षित जीन या डीएनए के टुकड़े को एक वृत्ताकार डीएनए संरचना में डालने से शुरू होती है, जिसे प्लास्मिड कहा जाता है। इसे पूरा करने के लिए, विशेष एंजाइमों का उपयोग किया जाता है, जिन्हें प्रतिबंध एंजाइम कहा जाता है, जो डीएनए खंडों को काटने और जोड़ने का कार्य करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप संयुक्त डीएनए का निर्माण होता है।
• संयुक्त डीएनए का परिचय: इसके बाद, संयुक्त प्लास्मिड को एक बैक्टीरियल सेल में पेश किया जाता है। ये बैक्टीरिया फिर प्लास्मिड के वाहक बन जाते हैं। विशेष बैक्टीरियल सेल जो सफलतापूर्वक प्लास्मिड को ग्रहण कर चुके हैं, का चयन किया जाता है और उन्हें उगाया जाता है।
• संयुक्त डीएनए का वृद्घि: जैसे-जैसे ये चयनित बैक्टीरिया प्रजनन करते हैं, वे प्लास्मिड द्वारा ले जाए जाने वाले संयुक्त डीएनए की नकल करते हैं। यह डीएनए नकल बैक्टीरियल सेल की प्रजनन प्रक्रिया के दौरान होती है और उनके संतान को हस्तांतरित की जाती है।
• डीएनए क्लोनिंग का उद्देश्य: डीएनए क्लोनिंग अक्सर आवश्यक होती है जब अनुसंधान उद्देश्यों के लिए डीएनए की बड़ी मात्रा की जरूरत होती है या नए प्लास्मिड बनाने के लिए। कुछ मामलों में, क्लोन किया हुआ डीएनए टुकड़ा एक लाभकारी प्रोटीन को कोड करता है। बैक्टीरिया को प्रोटीन फैक्ट्रियों के रूप में उपयोग किया जा सकता है, और इन बैक्टीरिया द्वारा संश्लेषित उपनिवेश प्रोटीन का उत्पादन करते हैं।
• उदाहरण: इंसुलिन उत्पादन: इस प्रक्रिया को स्पष्ट करने के लिए, मधुमेह रोगियों के लिए इंसुलिन उत्पादन पर विचार करें। इस मामले में, मानव इंसुलिन जीन को Escherichia coli (E. coli) बैक्टीरिया के डीएनए में क्लोन किया जाता है ताकि बैक्टीरिया इंसुलिन का उत्पादन कर सकें, जिसे फिर चिकित्सा उपयोग के लिए एकत्र किया जाता है।

डीएनए क्लोनिंग तकनीकें

लक्षित DNA का पृथक्करण

• लक्षित DNA संश्लेषित, पूरक, या जीनोमिक हो सकता है।
• यदि रुचि का जीनोमिक DNA टुकड़ा जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस से प्राप्त किया जा सकता है, तो इसे सीधे उपयोग किया जाता है।
• यदि नहीं, तो mRNA टेम्पलेट का उपयोग पूरक DNA (cDNA) टुकड़े बनाने के लिए किया जाता है।
• पॉलीएडेनिलेटेड mRNA को अफिनिटी कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके अलग किया जाता है।
• mRNA को cDNA में परिवर्तित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग किया जाता है।
• यह cDNA जीन के अटूट कोडिंग अनुक्रम को शामिल करना चाहिए।

विदेशी DNA का वेक्टर में प्रवेश

• पृथक cDNA को एक विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग करके टुकड़ों में काटा जाता है।
• समान एंजाइम का उपयोग करके cDNA और क्लोनिंग वेक्टर दोनों पर कोहेसिव एंड्स उत्पन्न किए जाते हैं।
• लिनियराइज्ड वेक्टर के सिरों पर पूरक एकल-धागे वाले DNA अनुक्रम जोड़े जाते हैं।
• यह डबल-धागे वाले cDNA को प्रभावी ढंग से वेक्टर में डालने की अनुमति देता है, जिससे स्टिकी एंड्स बनते हैं।

rDNA का बैक्टीरियल सेल में स्थानांतरण

• rDNA को एक उपयुक्त बैक्टीरियल मेज़बान सेल में पेश किया जाना चाहिए, जो ट्रांसफॉर्मेशन से गुजरता है।
• ट्रांसफॉर्मेशन वह प्रक्रिया है जिसमें विदेशी DNA वाला प्लास्मिड एक सेल में डाला जाता है।
• DNA ग्रहण को बढ़ाने के लिए एक हल्का हीट शॉक लागू किया जाता है।
• बैक्टीरिया को एंटीबायोटिक चयन माध्यम में कल्चर किया जाता है ताकि ट्रांसफॉर्म्ड सेल की पहचान की जा सके।

रिकॉम्बिनेंट क्लोन पहचान

• अंतिम चरण रिकॉम्बिनेंट प्लास्मिड वाले उपनिवेशों का चयन या स्क्रीनिंग करना है।
• एंटीबायोटिक चयन एक प्रभावी विधि है।
• बदलाव वाले बैक्टीरियल सेल विभिन्न एंटीबायोटिक्स वाले माध्यम पर प्लेटेड होते हैं।
• जो उपनिवेश बढ़ते हैं, वे उन प्लास्मिड को शामिल करते हैं, जो सामान्यतः एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ले जाते हैं।
• उदाहरण के लिए, प्लास्मिड pBR 322 टेट्रासाइक्लिन और एम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन ले जा सकता है, जिससे एंटीबायोटिक प्रतिरोध के आधार पर पहचान की जाती है।

DNA क्लोनिंग प्रक्रियाएँ

बिल्कुल, यहां एक विवरण दिया गया है कि कैसे डीएनए क्लोनिंग का उपयोग करके बैक्टीरिया को मानव इंसुलिन जैसे प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:

प्लास्मिड संशोधन

• पहले, वृत्ताकार डीएनए संरचना जिसे प्लास्मिड कहा जाता है, को खोला जाता है।
• विशिष्ट स्थानों पर प्लास्मिड डीएनए को काटने के लिए प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग किया जाता है।
• साथ ही, इच्छित जीन (इस मामले में, मानव इंसुलिन जीन) प्राप्त किया जाता है।
• डीएनए लिगेज का उपयोग करके जीन को खोले गए प्लास्मिड में जोड़ा जाता है। यह इंसुलिन जीन वाला एक संवहनीय प्लास्मिड बनाता है।

संवहनीय प्लास्मिड का बैक्टीरिया में परिचय

• अब इंसुलिन जीन ले जा रहा संवहनीय प्लास्मिड एक बैक्टीरिया मेज़बान सेल में पेश किया जाता है।
• मेज़बान सेल इस प्लास्मिड का प्राप्तकर्ता बन जाता है।

परिवर्तित बैक्टीरिया का चयन

• यह पहचानने के लिए कि कौन से बैक्टीरिया ने सफलतापूर्वक प्लास्मिड को ग्रहण किया है, एंटीबायोटिक चयन का उपयोग किया जा सकता है।
• प्लास्मिड में एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन हो सकता है।
• जो बैक्टीरिया प्लास्मिड को शामिल कर चुके हैं, वे एंटीबायोटिक की उपस्थिति में बढ़ने में सक्षम होंगे।
• गैर-परिवर्तित बैक्टीरिया एंटीबायोटिक युक्त वातावरण में जीवित नहीं रहेंगे, जिससे परिवर्तित कोशिकाओं का चयन किया जा सकेगा।

प्रोटीन का उत्पादन

• एक बार जब प्लास्मिड ले जाने वाले बैक्टीरिया की पहचान हो जाती है, तो उन्हें संस्कृति और गुणा किया जा सकता है।
• ये बैक्टीरिया इच्छित प्रोटीन, इस मामले में मानव इंसुलिन, का उत्पादन करने के लिए \"कारखाने\" के रूप में कार्य करते हैं।
• बैक्टीरिया अपनी सामान्य वृद्धि और प्रजनन चक्र का पालन करते हैं, जैसे-जैसे वे बढ़ते हैं इंसुलिन उत्पन्न करते हैं।

प्रोटीन का शुद्धिकरण

बैक्टीरिया द्वारा प्रोटीन उत्पादन के बाद, इसे शुद्ध करने की आवश्यकता होती है। विभिन्न तकनीकों, जैसे कि क्रोमैटोग्राफी, का उपयोग बैक्टीरियल कोशिकाओं से प्रोटीन निकालने और शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है। शुद्ध प्रोटीन का उपयोग चिकित्सा उद्देश्यों या अनुसंधान के लिए किया जा सकता है, जैसे कि मधुमेह रोगियों के लिए इंसुलिन का उत्पादन।

क्लोनिंग तकनीकें

बिल्कुल, यहाँ यह बताया गया है कि डीएनए क्लोनिंग का उपयोग बैक्टीरिया को प्रोटीन, जैसे मानव इंसुलिन, उत्पन्न करने के लिए कैसे किया जाता है, जिसमें प्रमुख चरणों पर ध्यान केंद्रित किया गया है:

डीएनए काटना और चिपकाना

• डीएनए को एक विशिष्ट लक्षित अनुक्रम पर या उसके निकट प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करके काटा जाता है।
• ये एंजाइम कटे हुए सिरों पर छोटे, एकल-धागे वाले ओवरहैंग उत्पन्न करते हैं।
• यदि ओवरहैंग मेल खाते हैं, तो दो डीएनए टुकड़े एक-दूसरे के साथ आधार जोड़ सकते हैं।
• डीएनए लिगेज, जिसे अक्सर आणविक गोंद कहा जाता है, का उपयोग टुकड़ों को जोड़ने के लिए किया जाता है, जो डीएनए की रीढ़ में गैप भरता है।
• इच्छित डीएनए (लक्षित जीन) को एक विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया जाता है, और प्लास्मिड को भी संगत सिरों को बनाने के लिए पचाया जाता है।
• फिर डीएनए लिगेज का उपयोग इन टुकड़ों को जोड़ने के लिए किया जाता है, जिससे एक रिकॉम्बिनेंट प्लास्मिड बनता है जिसमें लक्षित जीन होता है।

बैक्टीरियल ट्रांसफॉर्मेशन और चयन

• रिकॉम्बिनेंट प्लास्मिड, अन्य डीएनए टुकड़ों के साथ, बैक्टीरिया में एक प्रक्रिया के माध्यम से पेश किया जा सकता है जिसे ट्रांसफॉर्मेशन कहा जाता है।
• बैक्टीरियल कोशिकाओं को एक झटके के साथ व्यवहार किया जाता है, अक्सर गर्मी या इलेक्ट्रिकल विधियों के माध्यम से, ताकि उन्हें विदेशी डीएनए को ग्रहण करने के लिए प्रोत्साहित किया जा सके।
• प्लास्मिड अक्सर एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ले जाते हैं, जिससे प्लास्मिड ग्रहण करने वाले बैक्टीरिया एक विशिष्ट एंटीबायोटिक की उपस्थिति में जीवित रहते हैं।
• जो बैक्टीरिया प्लास्मिड की कमी रखते हैं वे एंटीबायोटिक की उपस्थिति में जीवित नहीं रहेंगे।
• सभी परिवर्तन किए गए बैक्टीरिया में सही प्लास्मिड नहीं होगा, क्योंकि लिगेशन प्रक्रिया में भिन्नताएँ होती हैं, इसलिए आमतौर पर सही वाले की पहचान के लिए कई कॉलोनियों की स्क्रीनिंग की जाती है।
• जांचने के लिए पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (PCR) और प्रतिबंध एंजाइम पाचन जैसी तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है कि इच्छित प्लास्मिड मौजूद है या नहीं।

प्रोटीन का उत्पादन

एक बार जब सही प्लास्मिड वाला बैक्टीरियल उपनिवेश पहचान लिया जाता है, तो इसे प्लास्मिड ले जाने वाले बैक्टीरिया के बड़े संस्कृति में बढ़ाया जा सकता है। ये बैक्टीरिया प्रोटीन फैक्ट्रियों के रूप में कार्य करते हैं, जो इच्छित प्रोटीन (जैसे, मानव इंसुलिन) का उत्पादन करते हैं। यदि प्लास्मिड में मानव इंसुलिन जीन होता है, तो बैक्टीरिया जीन को mRNA में ट्रांसक्राइब करते हैं और फिर इसे कई मानव इंसुलिन प्रोटीन के अणुओं का उत्पादन करने के लिए अनुवादित करते हैं। उत्पादन के बाद, बैक्टीरियल कोशिकाओं को प्रोटीन को मुक्त करने के लिए लिस किया जा सकता है। हालाँकि, लिसेट में लक्षित प्रोटीन के अलावा विभिन्न प्रोटीन और मैक्रोमोलेक्यूल होते हैं। कोशिका के घटकों से लक्षित प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए, कई जैव रासायनिक तकनीकों का उपयोग किया जाता है।

जीन क्लोनिंग के अनुप्रयोग

इन अनुप्रयोगों के लिए कुछ अतिरिक्त जानकारी और उदाहरण निम्नलिखित हैं:

जैवफार्मास्युटिकल्स

• इंसुलिन उत्पादन: पुनःसंयोजित DNA प्रौद्योगिकी मानव इंसुलिन के उत्पादन में महत्वपूर्ण रही है। इस प्रौद्योगिकी के पहले, मधुमेह के उपचार के लिए इंसुलिन जानवरों के अग्न्याशय से निकाला जाता था। आज, मानव इंसुलिन E. coli या यीस्ट कोशिकाओं का उपयोग करके संश्लेषित किया जाता है जो हार्मोन का उत्पादन करने के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर्ड होती हैं।
• टिश्यू प्लास्मिनोजेन एक्टिवेटर (tPA): tPA एक प्रोटीन है जिसका उपयोग रक्त के थक्कों को घोलने के लिए किया जाता है और यह स्ट्रोक रोगियों के उपचार में महत्वपूर्ण है। इसे जीन क्लोनिंग तकनीकों के माध्यम से उत्पादित किया जा सकता है, जिससे चिकित्सा उपयोग के लिए स्थिर और प्रचुर आपूर्ति सुनिश्चित होती है।
• मानव वृद्धि हार्मोन (HGH): मानव वृद्धि हार्मोन के लिए जीन क्लोनिंग करने से उन व्यक्तियों के लिए चिकित्सीय HGH का उत्पादन संभव होता है जिन्हें वृद्धि विकार होते हैं।

जीन थेरेपी

• सिस्टिक फाइब्रोसिस जीन थेरेपी: जैसा कि आपने उल्लेख किया, जीन थेरेपी का उपयोग आनुवंशिक बीमारियों वाले व्यक्तियों में जीन के कार्यात्मक प्रतियों को पेश करने के लिए किया जा सकता है। सिस्टिक फाइब्रोसिस के मामले में, CFTR जीन की सामान्य प्रति को पेश करना रोगियों के फेफड़ों के कार्य और समग्र स्वास्थ्य में सुधार कर सकता है। यह अभी भी अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है जिसमें विभिन्न वितरण विधियों की खोज की जा रही है।

जीन विश्लेषण

• कार्यात्मक जीनोमिक्स: क्लोनिंग वैज्ञानिकों को विशिष्ट जीन को अलग करने और उनके कार्य का अध्ययन करने की अनुमति देती है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ता बैक्टीरिया में औषधि प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार जीनों को क्लोन कर सकते हैं ताकि तंत्र को समझा जा सके और संभावित रूप से नए एंटीबायोटिक्स विकसित किए जा सकें।
• पुनःसंयोजित प्रोटीन: जैवफार्मास्युटिकल्स के अलावा, जीन क्लोनिंग का उपयोग शोध उद्देश्यों के लिए पुनःसंयोजित प्रोटीन के उत्पादन में किया जाता है। उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक एक विशेष एंजाइम को कोड करने वाले जीन को क्लोन कर सकते हैं ताकि उसके जैव रासायनिक गुणों का अध्ययन किया जा सके।